Materiales Luminiscentes: Fluoresceína

Los materiales luminiscentes I

Transcripto, reformulado y adaptado por Prof. Correa Juan.

"Los materiales luminiscentes liberan energía en forma de luz al regresar de los estados excitados. Los materiales fluorescentes son muy importantes en la investigación médica". P. W. Atkins (2006) "Principios de Química". 

Conozcamos a la Fluoresceína, ampliamente utilizada como un marcador fluorescente para muchas aplicaciones.

El 22 de marzo de 2010, un grupo de activistas de Greenpeace, vertió fluoresceína al riachuelo catalogando a ésta sustancia como "inocua". ¿Qué es la fluoresceína? ¿Realmente es inocua? 
¿Es adecuado utilizarlas en las fuentes de plazas de las ciudades?

Foto: Greenpeace. Martin Katz

Propiedades Físicas y químicas

Análisis macroscópico (lo que vemos a simple vista)

La fluoresceína es conocida por dar una solución color verde fluorescente en agua. Un compuesto estable a temperatura ambiente es la fluoresceína de sodio, que está disponible como un polvo de color naranja/rojo oscuro, es combustible, es soluble en agua y alcohol, entre otras propiedades. Se puede consultar la ficha técnica de la fluoresceína de sodio, por ejemplo en la página web de la prestigiosa compañia Merck en Merck S.A. Lo curioso de ésta ficha es que se advierte que no es una sustancia peligrosa según el reglamento de la Comunidad Europea Nº 1907/2006, pero tiene efectos irritantes en nariz, ojos y piel; además aconseja en no tirar sus residuos por el desagüe, para ello deben eliminarse de acuerdo con la directiva sobre residuos 2008/98/CE.
Siguiendo con otras propiedades, el color de su solución acuosa puede variar de verde a naranja como una función de la forma en que se observa: por reflexión o por transmisión. Esto se puede observar en los niveles de burbuja en el que se añade éste colorante al alcohol y al llenar el tubo aumenta la visibilidad de la burbuja de aire y la precisión del instrumento. Las soluciones más concentradas de fluoresceína, incluso puede aparecer de color rojo.

Análisis submicroscópico (lo que no vemos a simple vista)

Comencemos con su composición y estructura. La fluoresceína es un compuesto orgánico sintético, porque posee C,H y O. Su fórmula molecular es C20H12O5. Su fórmula estructural semidesarrollada nos permite ver los enlaces y sus funciones químicas:
                         

Podemos apreciar que posee cuatro tipos de funciones químicas orgánicas: dos funciones alcohol -OH, dos funciones éter -O-, una función cetona C=O y funciones alqueno=. Pero siguiendo el orden de prioridades la molécula de fluoresceína es una cetona su nombre sistemático es: 3',6'-Dihidroxi-3H-espirol [2-benzofuran-1,9'xanten]-3-ona.
La anterior fórmula estructural no nos da la verdadera estructura en el espacio. Para ello se utiliza por ejemplo, la fórmula de trazos o los modelos tridimensionales. La molécula de fluoresceína tiene una forma de avión a mi criterio. Ver molécula de Fluoresceína en 3D.

Siguiendo con las propiedades fisico-químicas, la fluorescencia de esta molécula es muy intensa, se produce la excitación de la molécula (absorción máxima) a 494 nm y un máximo de emisión de 521 nm. La Fluoresceína también tiene un punto de isosbéstico a 460 nm. Este material también se conoce como un aditivo de color. La forma de sal disódica de fluoresceína se conoce como uranina o D y C Amarillo no. 7 u 8. La Fluoresceína tiene un pKa de 6,4, y su equilibrio de ionización conduce a la absorción dependiente del pH y las emisiones durante el intervalo de 5 a 9. Además, los tiempos de vida de fluorescencia de las formas protonadas y desprotonadas de fluoresceína son aproximadamente 3 y 4 ns, lo que permite la determinación del pH a partir de mediciones basadas en nonintensity. Las vidas pueden ser recuperados utilizando correlacionado con el tiempo el recuento de fotones individuales o fluorimetría de modulación de fase.

Derivados

Hay muchos derivados de fluoresceína. Por ejemplo, isotiocianato de fluoresceína 1, a menudo abreviado como FITC, es la molécula de fluoresceína original, funcionalizado con un grupo isotiocianato, en sustitución de un átomo de hidrógeno en el anillo inferior de la estructura. Este derivado es reactivo hacia los grupos amino primarios de compuestos biológicamente relevantes, incluyendo proteínas intracelulares para formar un enlace tiourea. Un grupo funcional éster de succinimidilo unido al núcleo de fluoresceína, la creación de NHS-fluoresceína, forma otro derivado de amina-reactivo común, produciendo aductos de amida más estables. Ésteres y ésteres de pentafluorofenilo tetrafluorofenil son otros reactivos útiles. En la síntesis de oligonucleótidos, que contienen varios reactivos de fosforamidita de fluoresceína protegida, por ejemplo, 6-FAM fosforamidita 2, son ampliamente utilizados para la preparación de oligonucleótidos marcada con fluoresceína.

Otros colorantes verdes incluyen Oregon Green, Tokio verde, SNAFL, y carboxynaphthofluorescein. Estos colorantes, junto con los nuevos fluoróforos tales como Alexa 488, 488 y FluoProbes DyLight 488, han sido adaptados para diversas aplicaciones químicas y biológicas donde mayor fotoestabilidad, diferentes características espectrales, o diferentes grupos de fijación se necesitan.

Síntesis

La fluoresceína fue sintetizado por primera vez por Adolf von Baeyer en 1871. Se puede preparar a partir de anhídrido ftálico y resorcinol en presencia de cloruro de cinc a través de la reacción de Friedel-Crafts.

Un segundo método para preparar fluoresceína utiliza el ácido metanosulfónico como un catalizador ácido de Brönsted. Esta ruta tiene un alto rendimiento en condiciones más suaves.

Aplicaciones

La fluoresceína es un fluoróforo comúnmente utilizado en microscopía, en un tipo de láser de colorante como el medio de ganancia, en el análisis forense y la serología para detectar manchas de sangre latentes, en el rastreo de tinte, etc.

La investigación bioquímica

En la biología celular, el derivado de isotiocianato de fluoresceína se utiliza a menudo para etiquetar y rastrear células en aplicaciones de microscopía de fluorescencia. Moléculas biológicamente activas adicionales también pueden estar unidas a la fluoresceína, lo que permite a los biólogos dirigir el fluoróforo a las proteínas o estructuras específicas dentro de las células. Esta aplicación es común en la presentación en levadura.

Los colorantes como la fluoresceína pueden adherirse a moléculas de proteína y la proteína puede ser rastreada en un sistema biológico excitando la fluoresceína y buscando sus emisiones. El empleo de un material fluorescente permite la detección de concentraciones mucho más pequeñas de lo que sería posible de otra forma. Debido a que los materiales fluorescentes pueden ser activados mediante radiactividad, también se los utiliza en concentradores de centelleo para medir la radiación.

La Fluoresceína también se puede conjugar a nucleósidos trifosfato y se incorporan en una sonda enzimáticamente para la hibridación in situ. El uso de fluoresceína amidita le permite a uno para sintetizar oligonucleótidos marcados para el mismo propósito. Sin embargo, otra técnica denominada balizas moleculares hace uso de oligonucleótidos marcados con fluoresceína sintéticos. Sondas marcadas con fluoresceína se pueden visualizar mediante FISH o el blanco de los anticuerpos mediante inmunohistoquímica. La última es una alternativa común a la digoxigenina, y los dos se usan conjuntamente para el etiquetado de dos genes en una muestra.

Aplicaciones de cuidado de la salud

La "Fluoresceína de sodio", la sal sódica de fluoresceína, se utiliza ampliamente como una herramienta de diagnóstico en el campo de la oftalmología y optometría, donde se utiliza fluoresceína tópica en el diagnóstico de abrasiones de la córnea, úlceras corneales e infecciones corneales herpéticas. También se utiliza en la adaptación de lentes de contacto rígidas permeables al gas para evaluar la capa de lágrima debajo de la lente. Se presenta en sobres estériles de un solo uso que contienen aplicadores de papel sin pelusas humedecido en fluoresceína sódica.

La Fluoresceína por vía intravenosa u oral se utiliza en la angiografía con fluoresceína en la investigación y para diagnosticar y clasificar los trastornos vasculares, por ejemplo en piernas, incluyendo la degeneración retiniana la enfermedad macular, retinopatía diabética, enfermedades inflamatorias intraoculares, y tumores intraoculares, y, cada vez más, durante la cirugía para los tumores cerebrales.

Rescate aéreo-marítimo

Durante la Primera Guerra Mundial, la tripulación aérea alemana llevó pequeños contenedores de fluoresceína. En caso de lanzarse un paracaidista en el mar después de haber sido derribado, el tinte se liberaba en el agua. Esto producía un marcado vívido que se podía ver desde el aire a grandes distancias, que permitía ayudar a rescatar a la tripulación derribada. Esta técnica fue adoptada por otras fuerzas aéreas.

Usos en sistemas fluviales

Uno de sus usos más reconocibles estaba en el río Chicago, donde la fluoresceína fue la primera sustancia que se usaba para teñir el río de verde en 1962 en el Día de San Patricio. En 1966, los ambientalistas forzaron un cambio en una base de tinte de vegetales para proteger la fauna local.

Otras aplicaciones de fluoresceína incluyen el uso como un colorante soluble en agua añadida al agua de lluvia en las simulaciones de pruebas ambientales para ayudar a localizar y analizar las posibles pérdidas de agua, y en Australia y Nueva Zelanda como un tinte de alcohol desnaturalizado.

Aplicación Oilfield

Las soluciones de colorante fluoresceína, por lo general 15% activo, son comúnmente utilizados como una ayuda para la detección de fugas durante la prueba hidrostática del submarina de petróleo y gasoductos y otras infraestructuras submarinas. Las fugas pueden ser detectadas por los buceadores que llevan luces ultravioletas.

Seguridad. Reacciones adversas y efectos secundarios.

El uso tópico, oral e intravenosa de fluoresceína puede causar reacciones adversas, incluyendo náuseas, vómitos, urticaria, hipotensión aguda, anafilaxia y reacción anafilactoide relacionada, causando paro cardíaco y muerte súbita debido a un choque anafiláctico.

La reacción adversa más común son las náuseas, debido a una diferencia en el pH del cuerpo y el pH de la tintura de fluoresceína de sodio; sin embargo, se consideran contribuyentes también un número de otros factores. Las náuseas generalmente es transitorio y desaparece rápidamente. Las ronchas pueden variar desde una molestia leve a grave, y una sola dosis de antihistamínicos pueden dar un alivio completo. Shock anafiláctico y paro cardíaco posterior y muerte súbita son muy raros, pero debido a que se producen en cuestión de minutos, un médico que utiliza fluoresceína deben estar preparados para llevar a cabo la resucitación de emergencia.

El uso intravenoso tiene los efectos secundarios más reportados, incluyendo la muerte súbita, pero esto puede reflejar un mayor uso en lugar de mayor riesgo. Ambos usos orales y tópicos han sido descritas como causantes de anafilaxia, incluyendo un caso de anafilaxia con paro cardíaco tras el uso tópico en una gota ocular. Las tasas de reacciones adversas varían de 1% a 6%. Las tasas más altas pueden reflejar poblaciones de estudio que incluyen un mayor porcentaje de personas con reacciones adversas anteriores. El riesgo de una reacción adversa es 25 veces mayor si la persona ha tenido una reacción adversa previa. El riesgo se puede reducir con el uso previo de antihistamínicos y gestión de emergencias del sistema de cualquier anafilaxis posterior. A prueba de punción simple puede ayudar a identificar a las personas que corren mayor riesgo de reacciones adversas.


Bibliografía
P. W. Atkins (2006) "Principios de Química". Ed. Médica Panamericana. Madrid
http://www.greenpeace.org/argentina/es/fotos-y-videos/fotos/garcia-uriburu-8/ Visado el dia 15 de octubre de 2013.
http://centrodeartigos.com/articulos-de-todos-los-temas/article_30681.html Visado el día 15 de octubre de 2013.
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http://www.chemspider.com/Chemical-Structure.15968.html Visado el día 16 de octubre de 2013.
http://en.wikipedia.org/wiki/FluoresceinVisado el día 16 de octubre de 2013.

FICHA DE DATOS DE SEGURIDAD - Merck Millipore Visada el día 16 de octubre de 2013.